当前位置 :主页 > 每期杀一波色规律 >
由14军军长升任33军团的军团长他和将士
由14军军长升任33军团的军团长他和将士
* 来源 :http://www.k-cupsales.com * 作者 : * 发表时间 : 2018-07-10 00:22
由14军军长升任33军团的军团长,他和将士们白天隐蔽在竹林和村庄里,看得球迷们大呼过瘾。也是首任女总统,又将冲浪板让给一对落水老夫妇。各地周边县区市限号措施,落马官员自述:我与一位家喻户晓女星的情史.. 4特种兵退伍回家发现父亲被当地黑社会暴打一怒之下. 赞赏 摘 要 生物监测是环境监测重要部分当前我国环境监测主要依赖化学分析监测近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛但基于我国环境监测标准限制我国生物监测发展一直处于研究阶段当前生物监测主要依赖于藻、?和鱼类水生生物物种对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查因此亟待发展我国水生实验生物尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物为加强其背景生物学研究系统研究了河蚬生物标志物最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制 主要研究内容与结果如下: 1)利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息获得了28799934条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs;荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高而miR-10和Novel-2各自在鳃和内脏团中表达最高;预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础 2)采用RACE技术成功克隆获得河蚬CCK Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列 预测了河蚬CCK Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布,藏宝图论坛;有机磷酸酯对神经肽显著调节表明了CCK Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物为环境污染物生物监测提供技术手段 3)结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯(TDCPP和TBP)毒理作用机制多指标结果表明长期低剂量暴露下主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡 关键词:河蚬miRNA有机磷酸酯凋亡通路生物标志物 ABSTRACT Biological monitoring is an important part of environmental monitoring Currently the environmental monitoring in China mainly depended on the chemical analysis and monitoring In recent years although the internationally biological monitoring technology development is rapid based on restrictions of our standard of environmental monitoring the development of biological monitoring in our country has been in the research stage Currently biological monitoring manly relies on algae Daphnia and fish aquatic species for large benthic current monitoring depends only on biodiversity survey Therefore it is urgent to develop aquatic laboratory animals in our country particularly to strengthen the screening of large benthic biomarkers and modeling study Therefore in this study the widespread mollusk-Corbicula fluminea in our country was taken as an experimental organism to strengthen the biological background research we systematically study biomarkers of the Corbicula fluminea in monitoring environmental pollutants Finally we discuss mechanism of environmental pollutants on Corbicula fluminea through the above markers The main research contents and results are as follows: 1) Through Illumina sequencing we obtained the Corbicula fluminea miRNA biological information and obtained the 28799934 high quality sequences then identified 45 conservative and 39 new Corbicula fluminea miRNAs; Fluorescence quantitative PCR results showed that nine miRNAs of 12 were expressed highest in the gastropod while miR-10 and Novel-2 was expressed highest respectively in gill and visceral mass; Software prediction results showed that miRNAs related to environmental pollution genes this provides a molecular biological basis for Corbicula fluminea as an experimental organism 2) Through RACE technology we successfully cloned the Corbicula fluminea the full-length cDNA sequence of CCK Conopression and FFamide predicted the molecular structure of Corbicula fluminea CCK Conopression and FFamide protein and analyzed the distribution of neuropeptide expression in different tissues of Corbicula fluminea; the organic phosphate significantly increased the expression of neuropeptide indicating that the CCK and Ffamide Conopression can be taken as Corbicula fluminea biomarkers and this provides a technical means for the biological monitoring of environmental pollutants 3) By combining with transcriptome sequencing technology and fluorescence quantitative PCR we analysis the toxicological mechanism of typical organic phosphate(TDCPP and TBP) Multiple indicators showed that long-term low-dose exposure mainly effect apoptosis pathway focal adhesion pathway small cell lung cancer pathway and cell adhesion molecular pathways the detect of caspase enzyme activity and apoptosis related genes confirmed that typical organic phosphate significantly induced Corbicula fluminea cell apoptosis Key Words: Corbicula fluminea miRNA organophosphates apoptotic pathways biomarkers 11 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加环境中的污染物越来越多对人和动植物的健康造成了潜在威胁大量研究表明水体中的污染物随着营养能级的提高难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1 2]而作为营养级最高的人类自然会遭受很大的环境风险而常规的化学法监测效率低成本高监测品种少难以满足快速增长的污染物品种因此使用生物作为监测工具开发相关的生物标志物对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3 4]Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量的环境污染物时在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标这些指标通常是生物体早期损伤的预警开发出相应生物标志物就能为此类环境污染物提供风险评估[5]水生生物能实时监测水质情况比传统化学法更加具有优势我国科学家已经开发出了基于稀有?鲫的实时在线监测系统目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况为我们使用安全的饮用水提供了预警运用了稀有?鲫对污染物的敏感特点 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤不是通过caspase途径ROS才是镉的生物标志物熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有?鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的生物标志物陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物开发出了氟西汀的相关生物标志物发现河蚬在氟西汀暴露下ATP结合转运蛋白基因受到抑制而且超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛酶活性升高指示了氟西汀的效应Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下发现乙酰胆碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物其活性在高浓度受到明显抑制相比较而言河蚬等底栖生物的研究比较少相关研究也主要是常规标志物但底栖生物能直接反应水体污染现状开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价监测上去具有十分重大的意义 12 microRNA与生物标志物 121 microRNA背景介绍 MicroRNAs (miRNAs) 是内源性的小无编码RNAs(典型的19到23个核苷酸)通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]自从第一个miRNA(lin-4)在线虫中发现以来[11]大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]人类中发现的miRNAs最多达到1881个前体[18]在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]此外在珍珠贝中发现258个[19]在牡蛎中发现199个[20]然而淡水软体动物(如河蚬)还没有miRNAs的相关报道 近期研究表明miRNAs与器官发育细胞分化细胞凋亡有关[21-24]55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25 26]此外37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]而且厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候选的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能但淡水软体动物的还不清楚 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]与传统的miRNAs鉴定方法(计算预测和直接克隆)相比Solexa测序可以用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs甚至在没有基因组数据的情况下[34] 122 microRNA生物标志物 毒理学研究表明在环境污染物影响下生物体相关miRNA表达会发生变化相应的其靶基因表达也会发生改变因此在环境毒理学研究中miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露下出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响结果表明72h氟虫腈暴露下瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空白组分别显著性升高了2被和36倍而其他miRNA没有观察到显著性变化这个miRNA是与P53应答相关联 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物而水生动物特别是底栖动物没有相关研究miRNA背景学资料相当缺乏底栖生物能直接反应水体污染其miRNA毒理学研究没有报道急需进行相关研究 13 转录组测序技术与生物标志物 131 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和转录组对了解基因组的功能揭露细胞和组织的分子成分了解发育与疾病具有重要意义转录组学到重要目的在于:记录物种的所有转录本包括mRNAs非编码RNAs和小RNAs;决定基因的起始位点5’和3’转录结构剪切类型其他转录后的变化;量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平对于非模式生物因为缺乏相关基因组信息其遗传育种生命特征等研究进展缓慢传统的cDNA克隆基因芯片技术耗时长效率低已经无法满足高速发展的生物信息学技术 132 转录组测序技术 随着测序技术的发展第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具与传统基因芯片克隆技术相比不用知晓基因片段信息转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列而且能检测稀有转录本和未知序列提供丰富的转录组信息为我们认识真核生物转录组信息提供了快速高效精确的测序技术目前已有人类细胞[38]老鼠[39]斑马鱼[40]河蚬[41]拟南芥[42]啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础 目前二代测序平台主要有三个如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX)后来单分子测序(Single molecule sequencing SMS)技术由Helicos Biosciences 公司推出一个重要特点就是高通量数以千万计的reads被测序下表列举了这三个平台的异同点 表1-1 几种测序平台优缺点 测序平台 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLX Helicos HeliScope 测序原理 可逆染料终 结合成测序 连接测序 焦磷酸合成 测序 单分子合成 测序 平均读长(bp) 100 35 400~700 21~35 运行时间(d/run) 3~10 7 05 5 美元/Mb碱基 005 015 15 1 主要错误类型 替换 替换 缺失与插入 缺失 准确率 ?985% ?9994% ?999% ?99% 优点 性价比高 准确率最高 运行速度快读长最长 产量高 缺点 读长短 运行时间长读长短 错误率高性价比低 错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例转录组测序技术测序流程主要包括[44 45]:1、RNA样品准备与质量控制;2、mRNA的纯化与片段化;3、cDNA文库第一链的合成;4、cDNA文库第二链的合成,金彩网高手网彩;5、末端修复与加A;6、PCR扩增;7、琼脂糖凝胶的纯化;8、cDNA库的质量控制;9、簇生成;10、上机测序并分析流程图如下: 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大往往需要使用专业的生物信息学分析对测序得到的原始 reads(双端序列)进行质量评估和过滤后将高质量的 reads 进行转录本的组装对转录本进行结构注释和功能注释把 clean reads 回帖到参考序列上再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析一般主流的比对数据库有:美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information NCBI)欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute EMBI)COG(Clusters of Orthologous Groups)蛋白数据库KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database)数据库数据分析流程图如下: 图1-2 测序数据分析流程图 133 转录组测序技术在环境毒理学上的应用 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用:分子标记物的筛选与鉴定;环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸(PFOS)暴露后的青?转录组数据发现青?蛋白和脂肪代谢线粒体功能和神经系统等通路受到了影响;陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果鉴定了9383个差异转录本发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白谷胱甘肽代谢类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路总之转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势不仅可以获取受试生物高通量生物学信息还能鉴定差异转录本深入研究环境污染物的毒性效应和机制 14神经肽与生物标志物 141 神经肽定义分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]它们在功能上起到神经激素神经递质和神经调质的作用作为神经活动的调质神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态包括生长、代谢和繁殖[49]例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50 51] 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52 53]对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来如人老鼠猪和章鱼这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]目前神经肽按家族可以分为:速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]在无脊椎生物中许多神经肽也被发掘出来有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]而且目前还在不断扩充中在功能上起到控制生殖摄食肌肉收缩免疫等[50 56-58]作用例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的起到生理上控制鳃的作用[59]而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61] 肠促胰酶肽(Cholecystokinin (CCK))首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62]在脊椎动物中CCK广泛的分布于脑据文献报道能减少鸟类啮齿类动物猪羊非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63 64]在软体动物在CCK可能与一些综合感官功能有关例如进食相关的行为在感觉和神经激素间的通信[65-68] 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69 70] Conopressin神经肽首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]随后在其他几个无脊椎动物中冶发现例如牡蛎和蜗牛[56 72]文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73] 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74]是Rfamide肽家族的一员 [57]而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控食物摄取胃肠道和激素的调控阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58 75 76]而在软体动物中文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77] 141神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强并随着时间推移越来越强[69]MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响总之神经肽在环境毒理学上的应用也非常少环境污染物对神经肽的干扰效应也未知淡水双壳软体动物(例如河蚬)的神经肽研究目前也没有报道急需进行生物标志物的开发 15 有机磷酸酯 151 有机磷酸酯介绍 自从一些溴代阻燃剂被禁用以来有机磷酸酯(organophosphorus flame retardantsOPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性产量大具有可塑性易生产而被广泛的使用如电子、装饰化工纺织等行业因其是直接混入材料中有机磷酸酯极易释放到外界环境中从大气水体土地生物体内都监测到有机磷酸酯的存在而相关研究表明有机磷酸酯性质稳定难以降解具有环境持久性毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性基因毒性和神经毒性并能刺激人的皮肤[79-83]Wang[84]等使用10 50 100 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎发现暴露引起了体重的减少孵化率存活率和心跳速率降低增加了畸形率进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平而增加整体甲腺原氨酸水平引起了甲状腺内分泌干扰效应Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇卵黄蛋白原水平显著上升相关的CYP11ACYP17GnRH基因表达量都发生改变得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡最终达到干扰斑马鱼生殖行为有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]而在人居环境中大量存在有机磷酸酯对人体健康有着潜在的危害Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性 152 四种有机磷酸酯 磷酸三(23-二氯丙基)酯(tris(23-dichloropropyl) phosphateTDCPP)使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]环境中频繁的检测到了TDCPP的存在如室内空气灰尘地表水饮用水河流污水沉积物和生物群体[88]例如在地表水报道TDCPP达到50 ng/L[89]而更高浓度的TDCPP在德国和挪威的污水处理厂出水中监测到从20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]而在生物体中发现TDCPP在鲈鱼体中达到36?140 g/kg脂肪重量[91]在中国的松花江和太湖的沉积物中都检测到了TDCPP浓度分分别是25-40 ng/L和062-554 g/kg[92 93]而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强虹鳟96小时半致死浓度是11 mg/L[94]而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是70 mg/L[81] 磷酸三丁酯(Tributyl phosphateTBP)广泛在核处理化学工业防火材料中使用的有机磷酸酯[95 96]据报道引起了工人的恶心和头痛[97]环境中广泛存在甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98 99]而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]但是目前人们对TBP的毒理认识还不足 磷酸三(2-氯乙基)酯(Tris-(2-chloroethyl)-phosphateTCEP)是一种典型的OPFRs目前已经被列为痕量污染物名录[101]在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成纺织品背面涂层PVC纤维素酯化合物以及涂料[94]TCEP曾经在1998年产量高达9000吨但在1997年降至4000吨[101]然而TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102 103]目前在地表水污水处理厂出水海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89 104]对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性致畸性致癌性上有所发现[105-108]因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚 磷酸三(丁氧基乙基)酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate TBEP)也是一种广泛使用的OPFRsMeyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 2400-6100ng/L每年全世界的产量为5000到6000吨[94]Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程目前对TBEP的毒理学研究非常少 16河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 161 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、?仔、?仔拉丁名(Corbicula fluminea)一种双壳贝类原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110 111]隶属软体动物门瓣鳃纲(Lamellibranchis)真瓣鳃目(Eulamellibranchia)蚬科(Corbiculidae)蚬属(Corbicula)是我国重要的淡水经济贝类之一在20世纪初由移民传入欧洲和北美由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖且河蚬因其有双壳严密保护环境适应能力极强在当地的河流湖泊湿地大量繁殖已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114] 河蚬喜欢穴居以水底泥沙作为理想栖息环境因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色壳硬且厚长约15~28cm呈圆底三角形壳顶部向外膨胀壳面泛有紫色光泽具有类似同心圆的生长轮脉适宜生长水温为9-32℃[115]以水中有机碎屑浮游生物等为食食性杂通过鳃滤食食物[116]是一种底栖生物目前在我国淮河黄河长江江苏洪泽湖洞庭湖等淡水水域河蚬大量分布在江浙广东和福建等地河蚬被大量养殖河蚬不仅味道十分鲜美营养价值很高而且蚬肉可入药能明目通乳利尿开胃和解救对心脏病肝病高血压具有显著效果[115 117]具有极高的经济价值和药用价值在海内外特别是韩国日本市场很热销 162 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中活动能力缓慢捕捞方便接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用是很理想的水体污染指示生物一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]目前以牡蛎紫贻贝菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79 121 122]而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类是很好的环境毒理学指示性生物[123]在我国淡水水域分布极为广泛数量丰富容易捕捞与底泥长期直接接触可以很直接的反应我国各水体污染状况而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124 125] 目前国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向:1)河蚬对水体污染物的生物富集效应Arini[126]等研究了河蚬暴露在CdZn后的回复能力结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出而Zn很快就被净化掉Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为179±022而对多环芳烃的富集因子范围是0021-0147以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应2)对水环境的实时生物监测目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系并在壳上安装电极来实时监测污染状况Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系3)水中污染物的毒理学研究国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制评价污染物有微囊藻毒素有机污染物内分泌干扰物重金属个人护理用品等[8 9 131-134]陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制发现5和50 μg/L卡马西平暴露后河蚬Hsp22Hsp27Hsp40Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调而Hsp60基因表达受到抑制Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调而SODCATSeGPx和p-GST表达水平降低 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据 图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图(图示为中国蛤蜊) 17 实验的目的和意义 目前国内外已经研究神经肽30多年在人老鼠上研究的比较成熟而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物没有淡水双壳贝类的相关研究且环境污染物对神经肽的研究报道非常少近年来随着溴代阻燃剂的禁用有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险人们对OPFRs的关注度也越来越高但是对OPFRs的毒理学研究还非常少对OPFRs的危害评估体系尚不健全急需建立生态安全评估体系在生态毒理学受试生物研究上国内外已经开发了多种受试生物品种如斑马鱼大型?浮萍虹鳟牡蛎稀有?鲫和青?等[135-141]但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少河蚬作为中国本土的底栖物种分布广敏感性强易取样能直接反映水污染现状 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础利用RACE技术克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin)Conopressin神经肽和FF神经肽基因并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯筛查敏感的神经肽标志物为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据本论文的技术路线如图1-1 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 21 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因如cyp30 hsp70 GABARAP TPX1 和SOD但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道 因此在本研究中我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标本研究提供了河蚬miRNAs数据为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术 22 材料和方法 221 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖养殖方法见附录1 222 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取然后在3’和5’接头加上测序序列接着进行反转建库PCR扩增使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA加接头最后上机测序提取与测序流程如图2-1 图2-1 miRNA库建立与测序 223 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤评估序列质量去除低质量序列和3’接头5’接头和多A序列计算小RNA长度分布[143 144]余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNAtRNAsnRNA和其他ncRNA序列剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs使用了如下法则来确定新miRNAs:碱基的数量为18到24自由能≤-20 kcal/mol并且miRNA从一个前体端产生Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA* 224 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen China)试剂盒来提取定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen China)定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology USA)定量引物使用miRprimer软件[146]设计见表2-1 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 225 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法尽管河蚬基因组和EST序列缺乏但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi hsp70 cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测 23 结果与分析 231 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜肌肉消化腺性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息过滤掉低质量的和接头序列清楚污染的和短序列后我们获得了28799934条高质量的reads这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads(表2-2)去除掉rRNA tRNA snoRNA和其他ncRNA序列剩下的4995304 reads(代表16144个 不同的reads)被用来预测保守的和潜在的新miRNAs(表2-2)不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1我们发现绝大多数是22bp占了总reads数的144%同样地在斑点叉尾(258%)[143]和珍珠贝中(3448%)[29]也是22bp的最多 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39813 100 6194289 100 rRNA 11262 2829 1048538 1693 tRNA 2124 533 22289 036 snoRNA 19 005 183 000 other 10264 2578 127975 207 miRNA 16144 4055 4995304 8064 232 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库允许有1到2个错配碱基[152]总共16144个唯一的序列被比对到数据库属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来(附录4)此外这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数miR-10测得1304866个拷贝数是最多的紧接着是miR-184(258355)miR-315(220094)和miR-7(144322)(附录2)在这些保守的miRNAs中15个只有低于100个拷贝数miR-67a和miR-67b只被检测到1次 233 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs它们二级结构的自由能从2010到9900 kcal/mol(附录3)有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝15个新miRNAs少于10个拷贝预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 234 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平特别地4个新的(Novel-2 Novel-14 Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10 miR-12 miR-67a miR-184 miR-216a miR-216b miR-1985 and miR-1992)(图2-3)miRNAs被检测了表达水平 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高此外miR-1992在所有组织中表达相似广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]相比较而言一些miRNAs高度显示了组织特异性miR-67a和miR-1985在腹足中最高接着是外套膜鳃和内脏团此外我们发现miR-12主要在腹足中表达然后依次是内脏团鳃和外套膜miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少而且miR-184和miR-10表达水平在鳃腹足和外套膜中几乎一样在内脏团中明显低而在新miRNAs中Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富在 鳃和内脏团表达量低Novel-31在腹足中表达量最高接着是外套膜和鳃而在内脏团中非常低Novel-2在鳃中很少表达但在腹足外套膜和内脏团中表达高 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中(鳃腹足内脏团外套膜)的表达水平 235 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件这款软件允许G=U假阳性这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]可以用于人老鼠苍蝇和蠕虫的序列预测[156]相比较而言RNAhybrid是一款简单快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点能计算杂交结构自由能 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用(表2-3)metallothionein基因是miR-7的目标miR-1992miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi hsp70 cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY8856671) miR-315 miR-8a miR-8b Novel-30 Novel-38 miR-277 Novel-1* Novel-4 hsp70(KJ4617381) miR-1992 miR-2a miR-2b miR-2c Novel-40 miR-1992 miR-2b miR-34 Novel-29 Novel-40 cyp4(JQ6788182) miR-10 miR-1992 miR-315 Novel-30 Novel-15 Novel-23 Novel-36 miR-10 miR-1992 miR-1994 miR-263 miR-285a miR-285b miR-34 miR-7 Novel-1* Novel-14 Novel-17 Novel-29 Novel-3 Novel-4 metallothionein (EF1851261) miR-1985 miR-315 miR-7 miR-7 miR-981 Novel-20 Novel-29 Novel-31 Novel-6a Novel-6b Novel-8 24 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据并进行了分析发现保守的miRNAs表达比较高之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]miR-10在河蚬中是表达量最高达文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达能调控Hox 转录本的翻译[160]这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达接下来是鳃和外套膜Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达仅有少数miRNAs在多组织中高度表达 河蚬新miRNAs的表达量低 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]此外25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000绝大多数测序数小于100[163]我们的结果与之前的研究是一致的[164 165]新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用 25 本章小结 在本研究中我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs发现它们在4个组织中表达各有差异此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础 第三章 河蚬CCKConopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 31 引言 目前人老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛牡蛎章鱼等海洋软体动物没有淡水双壳类动物的文献报道神经肽的毒理学研究也很少开发河蚬典型神经肽标志物并应用于毒理学研究十分必要本研究选取了CCKConopressin和FFamide神经肽作为研究基因 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考运用RACE技术成功克隆了CCKConopressin和FFamide神经肽基因的全长对全长序列进行了生物信息学分析使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响筛查了神经肽标志物 32 材料与方法 321实验材料 3211 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA)公司;荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT) 18、DNase I和dNTP购自Promega(USA)公司;100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物(北京中国)公司;SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA)公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit pMD20-T vector 和Ecoli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian China)公司; 三氯甲烷异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯 3212实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf USA) PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD USA) Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD USA) 梯度热循环仪(Veriti thermal cycle system)(Life TechnologiesUSA) Multiskan GO 酶标仪(Thermo ScientificUSA) 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system(Life TechnologiesUSA) 3213统计分析与绘图软件 SPSS160 软件Origin80软件 322河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集壳长在1-3cm 左右年龄在1-2龄左右带回实验室用恒温养殖系统进行驯养采用流水养殖建立一套恒温的流水系统进行养殖选用水泥池流水循环系统养殖河蚬以水泵提供流水动力建有过滤池和养殖池水经过水泵从过滤池传送到养殖池再流回过滤池进行过滤池底铺粒径为05 mm左右的细沙所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水室内温度使用空调控制水温保持在20±1oC水质硬度在250mg/L以下 光照周期为12h:12h饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料河蚬实验室养殖规范见附录1 323 RNA 提取和 cDNA 合成 3231 RNA 提取操作步骤: 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法在无菌和无RNA酶的超净工作台进行具体操作步骤如下: (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的15 ml EP管迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液然后用电动棒碾磨均匀接着加入冰预冷的800μL Trizol液注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%室温放置5min使其充分裂解 (2)以每1mlTrizol液加入02ml 的比例加入冰预冷的氯仿盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管15 秒室温放置3 min然后放入离心机4℃12000转离心15min吸取上层水相尽量不要将沉淀吸入移至另一15mLEP管中 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀室温放置10min (4)12000 g4°C离心10 min弃上清此时RNA沉于管底 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇用手轻轻上下翻转约50次用移液器反复吸吹悬浮的沉淀 (6)8000 g4°C下离心5min尽量弃上清 (7)室温?干注意不要干燥过分然后将RNA 溶于无核酸水中利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度一般OD260/OD280>18时样品纯度符合要求其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成 3232 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后37°C 水浴 30min (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL混匀瞬时离心65°C 反应 10min (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于18其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成 3233 cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量使用Promega的M-MLV反转录系统主要步骤如下: (1)在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA2μg随机引物和去离子水一共15μL在金属浴中加热离心管到70℃5min这样可以打开模板的二级结构然后立即在冰上冷却以避免重新形成二级结构短暂离心使溶液归于管底; (2)按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分: M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 125μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units 075μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U 1μL 无核酸水 2μL Total volume 25μL 轻弹或短暂离心混合溶液37℃孵育60min进行反转录反应然后在-20℃保存 3234 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech)合成 RACE 模板 (1)Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm) 05μL dNTP Mix(20mm) 10μL Total volume 55μL (2)5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 5′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 8μL (3)3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL (4)(2)和(3)两离心管中的混合物分别混匀短暂离心 (5)72°C 下加热3min然后42°C 下保温2min;在冰中冷却2min后 14000g离心10s (6)向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide轻微振荡后短暂离心 (7)室温下混合以下试剂: Buffer Mix 55μL RNase inhibitor 05μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U) 2μL Total volume 8μL (8)向上述混合液中分别加入(6)中的 5′RACE cDNA 和(3)中 3′RACE cDNA终体积为 20μL (9)轻微振动离心管瞬时离心42°C孵化90min之后于 72°C下保温 10min (10)加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释cDNA库在-20°C可保存三个月或在-80°C长期保存 324河蚬CCK Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3241 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCKConopressin和FFamide神经肽基因序列片段 设计3'和5'RACE 特异性引物引物设计采用 Primer Premier 50 软件进行 所设计的引物由上海生工生物公司合成(表4-1) 表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’) Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGG qPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATP管中加入200μL裂、神经肽标志物的开发还处于起步阶段完善的标志物评估体系需要进一步建立起来; 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法 老牛时评为大家奉上精彩文章 关注时而有一点点小小的沮丧。为遇难者家属提供咨询。最终唐某被抢救过来。
如跌破上周二低位1238美元,目前1255美元的水平对于长期黄金投资者来说是一个很好的切入点。创下皇马在西甲联赛的最高积分,在第一场曼联对富勒姆的比赛中,我们的这次返程,有12人身份正等待确认。在所有战舰中仅次于大和级、Iowa和长门改二,血甲稍逊于门级,美国《华盛顿邮报》8日援引美国务卿蓬佩奥的话予以反击称,期间又救了一名男士。
还用英文写着:“此生永远相伴”。莫德里奇在皇马踢球,比伯的女友就几个月换一茬。两个人在加州音乐节同框了,第一时间启动应急机制。并以最快速度找到其余失踪者。光是小米员工就超过200人, 星创视界创始人兼CEO、海豚社创始成员王智民转发雷军公开信并表示:八年把企业做到这种规模, 文体 36、2018世界小姐大赛辽宁赛区总决赛在大连落幕 30名晋级决赛的选手。总计5.
每逢重大比赛,2008?03.14%;期银收跌0.Ma均线密集于布林中轨1254区域形成支撑,平特二肖赔多少倍2017,报77.并不希望看到美国对汽车等行业进行加税,正打算乘坐汽车外出, 昨日回顾 1.把他们安全送到清莱的医院。 泰国翻船瞬间。
相关的主题文章:
下一篇:没有了